11 进阶练习

对于课程的最后部分，我们希望您能够解决更多开放式问题，执行您将为实际研究项目所做的分析类型。

拥有自己数据集的参与者可以随意使用它们。

对于其他参与者，建议从 conquer(consistent quantification of external rna-seq data)中下载数据集（外部rna-seq数据的一致量化）。 conquer使用 Salmon定量给定样本中的转录本丰度。 对于给定物种，fasta文件含有来自Ensembl的cDNA和ncRNA序列的与ERCC spike-in 互补序列，并且为整个目录构建Salmon quasi-mapping索引。 然后运行 Salmon来估计每个转录本的丰度。 Salmon估计的转录本了丰度汇总并以MultiAssayExperiment对象的形式提供给用户。 可以通过 _MultiAssayExperiment_列中的按钮下载此对象。提供的MultiAssayExperiment对象包含两个“实验”，对应于基因水平和转录水平表达值。

基因水平实验包含4个部分:

• TPM
• count
• count_lstpm (count-scale length-scaled TPMs)
• avetxlength (平均转录本长度, 见here).

转录水平包含3个部分:

• TPM
• count
• efflength (Salmon估计的有效长度)

MultiAssayExperiment还包含表型数据（colData中），以及数据集的一些元数据（基因组，物种和用于定量的Salmon索引）。

在这里，我们将向您展示如何从MultiAssayExperiment对象创建SCE。 例如，如果下载Shalek2013数据集，则可以使用以下代码创建SCE：

library(MultiAssayExperiment)
library(SummarizedExperiment)
library(scater)
d <- readRDS("~/Desktop/GSE41265.rds")
cts <- assays(experiments(d)[["gene"]])[["count_lstpm"]]
tpms <- assays(experiments(d)[["gene"]])[["TPM"]]
phn <- colData(d)
sce <- SingleCellExperiment(
    assays = list(
        countData = cts, 
        tpmData = tpms
    ),
    colData = phn
)

在 conquer网站上可以看到预先计算了几个不同的QC指标。

以下是您可以探索的一些问题建议：

• 来自不同实验室的两个mESC数据集（比如Xue和Kumar）。如何合并并删除批次效应吗？

• 聚类和伪时间分析寻找细胞之间的不同模式。哪个更适合你的数据集？

• 聚类的主要挑战之一是确定k的值。是否可以使用一个或多个聚类工具来探索细胞的不同层次结构？ 什么是确定k的数学和/或生物学黄金标准？

• 标准化策略的选择很重要，但是如何确定哪种方法最好？ 探索不同标准化对下游分析的影响。

• scRNA-seq数据集是高维的，但大多数维度（比如基因）都没有信息。因此，在分析和可视化数据时，降维和特征选择非常重要。 考虑不同特征选择和降维方法对聚类和伪时间分析的影响。

• 聚类后的主要挑战之一是解释亚群的生物相关性。一种方法是识别marker基因富集的gene ontology条目。 识别标记基因（例如使用SC3或M3Drop）并使用gProfiler，WebGestalt或DAVID进行富集分析。

• 类似地，当根据伪时间对细胞进行排序时，我们想要了解随时间变化的细胞过程。从比对的细胞中识别一组变化的基因，并使用GO item来表征它们。